Czy białka keratynowe i serycyna z jedwabiu mogą pomóc w leczeniu ran cukrzycowych?

Dr hab. Marek Konop otrzymał 3 950 734,00 zł dofinansowania od Narodowego Centrum Nauki w ramach konkursu OPUS na realizację projektu „Rola cytokeratyny 16 i 17 w gojeniu ran u szczurów z cukrzycą - badania mechanizmów molekularnych z wykorzystaniem biomateriału keratyna-serycyna”.

Dlaczego rany w cukrzycy goją się gorzej?

Gojenie rany jest precyzyjnie zaprogramowanym procesem. Najpierw organizm musi zatrzymać krwawienie oraz usunąć uszkodzone komórki i drobnoustroje. Następnie rozpoczyna odbudowę naczyń krwionośnych, tkanki łącznej oraz naskórka. Poszczególne etapy powinny następować po sobie w odpowiedniej kolejności.

W cukrzycy ten mechanizm zostaje zaburzony. Utrzymujący się przewlekły stan zapalny, stres oksydacyjny, gorsze ukrwienie i niedotlenienie tkanek sprawiają, że rana może utknąć w fazie zapalnej. Komórki odpowiedzialne za odbudowę skóry działają wolniej, a nowy naskórek nie przesuwa się prawidłowo nad powierzchnią rany. Szczególną rolę odgrywają tu makrofagi, czyli komórki układu odpornościowego obecne w ranie. Początkowo usuwają uszkodzone tkanki i zwalczają zagrożenia. Później część z nich powinna zmienić sposób działania i zacząć wspierać regenerację. W ranach cukrzycowych ta zmiana często nie przebiega prawidłowo. Dlatego sprawdzimy, czy nowy biomateriał może pomóc „przełączyć” środowisko rany z przewlekłego zapalenia na odbudowę tkanek  

Keratyna i serycyna – naturalne białka w nowej roli

Keratyna jest białkiem budującym między innymi włosy, wełnę, paznokcie i zewnętrzne warstwy skóry. Nie jest jednak wyłącznie biernym materiałem konstrukcyjnym. Odpowiednio przygotowana może tworzyć podłoże sprzyjające przyczepianiu, wzrostowi i przemieszczaniu się komórek odbudowujących naskórek.

Serycyna pochodzi z kokonów jedwabnika morwowego Bombyx mori. Otacza włókna fibroiny, z których powstaje jedwab. Przez lata była traktowana głównie jako produkt uboczny przemysłu jedwabniczego. Dziś wiadomo, że ma interesujące właściwości biologiczne: jest zgodna z tkankami, ulega biodegradacji, może ograniczać stres oksydacyjny i stan zapalny oraz wspierać tworzenie naczyń krwionośnych.

W projekcie połączymy oba białka w jeden kompozytowy materiał opatrunkowy. Keratyna ma tworzyć strukturę i wspierać komórki odbudowujące naskórek, a serycyna ma wzmacniać działanie ochronne i regeneracyjne. Zbadamy także modyfikacje materiału zawierające wybrane związki o potencjale przeciwzapalnym, antyoksydacyjnym i wspomagającym naprawę i regenerację tkanek. Każdy wariant zostanie oceniony osobno pod względem bezpieczeństwa, właściwości fizycznych i aktywności biologicznej.

Cytokeratyny 16 i 17 jako wskaźniki uruchomienia programu naprawczego naskórka.

Najważniejszym elementem projektu jest poznanie roli cytokeratyn 16 i 17 (KRT16/17). Są to białka wytwarzane przez keratynocyty, czyli podstawowe komórki naskórka. W zdrowej skórze ekspresja cytokeratyn 16 i 17 jest stosunkowo niska.  

Po zranieniu/urazie keratynocyty przechodzą w „tryb naprawczy”: zmieniają swój profil ekspresji genów, reorganizują cytoszkielet, przemieszczają się w kierunku ubytku i odbudowują ciągłość naskórka. Jedną z charakterystycznych cech tej aktywacji jest szybki wzrost ekspresji KRT16 i KRT17. Cytokeratyny te pełnią podwójną rolę: uczestniczą w zmianie właściwości i zachowania keratynocytów, a jednocześnie stanowią biologiczne wskaźniki uruchomienia odpowiedzi naprawczej. Ich obecność pozwala więc ocenić, czy keratynocyty zostały aktywowane i rozpoczęły proces reepitelializacji.

Aktywność cytokeratyn 16 i 17 w odbudowie naskórka musi jednak być odpowiednio regulowana. Zbyt słaba odpowiedź na uszkodzenie może opóźnić zamykanie rany, ale nieprawidłowa lub zbyt długa aktywacja także nie prowadzi do prawidłowego odtworzenia naskórka. Dlatego chcemy ustalić, jak zachowują się KRT16 i KRT17 w ranach cukrzycowych oraz czy biomateriały keratynowo-serycynowe i ich modyfikacje mogą przywrócić bardziej fizjologiczny przebieg gojenia.

Od hodowli komórkowych do modelu rany cukrzycowej

Badania będzie prowadzić interdyscyplinarny zespół łączący doświadczenie z zakresu fizjologii, biologii molekularnej, dermatologii i dermatopatologii oraz inżynierii biomateriałów, we współpracy z naukowcami ze Stanów Zjednoczonych, Hiszpanii i Wielkiej Brytanii.

Pierwszy etap projektu obejmuje przygotowanie różnych wariantów opatrunku i zbadanie ich struktury, porowatości, zdolności pochłaniania wody, trwałości oraz uwalniania badanych substancji. Materiał przeznaczony do kontaktu z raną musi bowiem nie tylko działać biologicznie, lecz także posiadać odpowiednie właściwości użytkowe.

Następnie przeprowadzimy badania in vitro na hodowlach komórkowych. Ocenimy, czy badane biomateriały są bezpieczne, czy wspierają wzrost i migrację komórek oraz jak wpływają na zapalenie, stres oksydacyjny i aktywność makrofagów. W laboratorium odtworzymy też warunki podwyższonego stężenia glukozy, aby lepiej naśladować środowisko u pacjentów z cukrzycą.

Aby potwierdzić, że obserwowane efekty rzeczywiście zależą od cytokeratyn 16 i 17, czasowo ograniczymy ich wytwarzanie w keratynocytach. Dzięki temu sprawdzimy, czy komórki pozbawione jednego z tych białek nadal reagują na biomateriał w taki sam sposób. Będziemy również analizować mechanizmy, za pomocą których komórki otrzymują sygnał do wzrostu, migracji i rozpoczęcia regeneracji.

Kolejnym etapem będą badania w modelu rany pełnej grubości u szczurów z cukrzycą typu 2. Ocenimy tempo gojenia, odbudowę naskórka i skóry właściwej, tworzenie naczyń krwionośnych, skład nacieku zapalnego oraz białka związane z regeneracją. Do tego celu wykorzystamy techniki mikroskopii świetlnej, fluorescencyjnej oraz techniki biologii molekularnej.

Co już wiemy?

Projekt nie zaczyna się od zera. Mój zespół opracował i zmodyfikował metody otrzymywania biomateriałów keratynowych i serycynowych z wykorzystaniem prostych, nietoksycznych odczynników. W naszych wcześniejszych badaniach wykazaliśmy, że opracowane przez nas biomateriały keratynowe, a także serycynowe są nietoksyczne i mogą przyspieszać gojenie ran. W ranach leczonych keratynową zasypką obserwowaliśmy więcej makrofagów o profilu sprzyjającym regeneracji, a także wzrost ekspresji KRT16 i KRT17.

Badania wstępne z serycyną również są obiecujące. Serycyna wspiera żywotność fibroblastów i wpływa na geny związane z zapaleniem, ochroną antyoksydacyjną oraz aktywacją keratynocytów. W komórkach naskórka obserwowaliśmy między innymi wzrost ekspresji KRT16 i KRT17 oraz nasilenie odpowiedzi związanej z enzymem SOD2, który pomaga chronić komórki przed stresem oksydacyjnym. 

Należy podkreślić, że są to wyniki wstępne, dlatego nie przesądzają jeszcze o skuteczności przyszłego opatrunku, ale stanowią solidną podstawę do dalszych badań.

Czy z projektu powstanie nowy opatrunek?

Celem projektu jest przede wszystkim wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, o których w literaturze jest niewiele informacji. Chcemy dowiedzieć się, dlaczego określony materiał działa lub nie działa, a nie tylko odnotować, że rana zamknęła się szybciej. Taka wiedza jest niezbędna, aby w przyszłości projektować opatrunki w sposób racjonalny i dobierać ich skład do problemów występujących w ranie przewlekłej.

Jeżeli nasze hipotezy się potwierdzą, otrzymane wyniki mogą stać się podstawą do opracowania bezpiecznego, biodegradowalnego i stosunkowo niedrogiego materiału wspomagającego leczenie ran szczególnie u pacjentów z cukrzycą. 

Jednakże, droga od badań laboratoryjnych do zastosowania u pacjentów jest długa. Wymaga optymalizacji materiału, potwierdzenia profilu bezpieczeństwa, standaryzacji produkcji oraz badań przedklinicznych i klinicznych. 

Dlatego nie obiecujemy gotowego produktu po zakończeniu projektu. Oczekujemy natomiast wiedzy, która pozwoli wskazać najbardziej obiecujące rozwiązania.

Naturalne materiały i medycyna przyszłości

Keratyna i serycyna są surowcami naturalnymi, dostępnymi i możliwymi do pozyskiwania metodami ograniczającymi wykorzystanie toksycznych rozpuszczalników. Ich zastosowanie wpisuje się w rozwój zrównoważonych biomateriałów, w których materiał pochodzenia biologicznego otrzymuje nowe zastosowanie medyczne.

Najważniejszym rezultatem projektu będzie jednak lepsze zrozumienie zachowania się komórek skóry w warunkach cukrzycy.

Poznanie roli KRT16 i KRT17 może wyjaśnić, dlaczego naskórek w przewlekłej ranie nie potrafi skutecznie zakończyć procesu naprawy. Połączenie tej wiedzy z technologią biomateriałów może w przyszłości pomóc w tworzeniu opatrunków, które nie będą jedynie osłaniały ranę, lecz aktywnie wpływały na jej środowisko biologiczne.