Mikroskopijne struktury o maksymalnym znaczeniu

dr Pyrzyńska, dr Czystowska-Kuźmicz

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są na całym świecie bardzo „gorącym” przedmiotem badań - zarówno podstawowych, jak i klinicznych. Wybitni eksperci ze świata dzielili się doświadczeniami i wiedzą na ich temat podczas konferencji organizowanej na naszej uczelni w ramach projektu EVIONA, finansowanego przez Narodową Agencję Wymiany Akademickiej (NAWA). Czego nowego dowiedzieliśmy się o mikropęcherzykach i jak to wpłynie na diagnostykę oraz terapię medyczną - wyjaśniają organizatorki wydarzenia: dr Małgorzata Czystowska-Kuźmicz i dr Beata Pyrzyńska z Katedry i Zakładu Biochemii WUM.

Czym właściwie są pęcherzyki zewnątrzkomórkowe?

Dr Małgorzata Czystowska-Kuźmicz: Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (ang. Extracellular Vesicles, EVs) są mikroskopijnymi strukturami o podwójnej błonie lipidowej wytwarzanymi przez wszystkie komórki, a w szczególnie wysokich stężeniach przez komórki nowotworowe. Kiedyś uważano, że pełnią one tylko rolę „koszy na śmieci” dla komórek, które w ten sposób pozbywają się szkodliwych produktów przemiany materii czy uszkodzonych organelli komórkowych. Liczne badania ostatnich lat wykazały jednak, że EVs pełnią kluczową rolę w komunikacji między komórkami, niezbędne są do zachowania komórkowej homeostazy, a także istotnie wpływają na procesy patologiczne, w tym na rozwój nowotworów. Ponieważ występują we wszystkich płynach biologicznych oraz odzwierciedlają skład molekularny komórek, z których pochodzą, są potencjalnym źródłem biomarkerów lub celów terapeutycznych, także w dziedzinie onkologii. Obecnie są tematem badań na całym świecie. Znalazły się również w kręgu zainteresowań zarówno start-upów w dziedzinie biotechnologii, jak i dużych firm farmaceutycznych. Dzięki intensywnym badaniom wiedza na ich temat bardzo szybko rośnie, tworząc wciąż nowe możliwości ich potencjalnego zastosowania w klinice. 

Dlaczego tak „wąskie” zagadnienie stało się tematem dwudniowej konferencji?

Dr Beata Pyrzyńska: Konferencja miała zapoznać społeczność naukową na WUM i w Polsce, szczególnie studentów i młodych naukowców, z tematyką pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i wzbudzić ich zainteresowanie tą dziedziną badań. Zagraniczni prelegenci, będący czołowymi ekspertami w dziedzinie badań mikropęcherzyków, jak również czołowi naukowcy z Polski, przedstawili swoje najnowsze badania w tej dziedzinie oraz podsumowali najnowszą wiedzę na ten temat. Omawiano ich znaczenie nie tylko w onkologii, ale także w medycynie regeneracyjnej, rozmawiano o całym wachlarzu ich potencjalnych zastosowań w klinice. 

Które z wystąpień i przedstawionych badań były szczególne?

Dr Małgorzata Czystowska-Kuźmicz: Na pewno duże znaczenia miała obecność prof. Theresy L. Whiteside  z Uniwersytetu w Pittsburgu, która jest jednym z pionierów badań mikropęcherzyków w immunoonkologii i ma 35-letnie doświadczenie w dziedzinie immunologii nowotworów i monitorowania statusu układu odpornościowego u pacjentów z nowotworami. Jako jedna z pierwszych wykazała wpływ mikropęcherzyków pochodzenia nowotworowego na przeciwnowotworową odpowiedź układu odpornościowego. Na konferencji przedstawiła, że profil molekularny egzosomów (jednego z podtypów pęcherzyków) znajdujących się w osoczu pacjentów nowotworowych może służyć do oceny ich statusu immunologicznego i pozwolić przewidzieć ich odpowiedź na immunoterapię. Co ciekawe, wykazała, że także pęcherzyki nie-nowotworowe, pochodzące np. od komórek układu odpornościowego, mogą w równym stopniu, co pęcherzyki nowotworowe, stanowić źródło biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych. Ponadto przedstawiła najróżniejsze mechanizmy wykorzystywane przez egzosomy do hamowania odpowiedzi przeciwnowotworowej, podkreślając konieczność systemowego podejścia przy próbach blokowania ich właściwości immunosupresyjnych. Prof. Monika Pietrowska - polski ekspert w badaniach proteomicznych egzosomów, współpracująca z prof. Whiteside, pokazała możliwości zastosowania proteomiki do analizy molekularnej pęcherzyków i dowiodła, że przy odpowiednim przygotowaniu próbek jest to doskonała metoda do identyfikacji nowych markerów diagnostycznych czy prognostycznych związanych z pęcherzykami. 
Dr Beata Pyrzyńska: Kolejny gość konferencji, prof. Janusz Rak z Uniwersytetu McGill w Montrealu, światowej sławy odkrywca onkogennej kontroli procesów formowania unaczynionego podścieliska nowotworowego (stroma), w tym regulacji czynników angiogennych, opowiadał o swoim odkryciu rozprzestrzeniania się onkogennych białek za pomocą mikropecherzyków i ich roli w nowotworowej zakrzepicy. Prof. Rak podkreślił, że pęcherzyki pośredniczą nie tylko w przenoszeniu onkogennych białek, ale także onkogennych mRNA, które inicjują ekspresję danych białek w komórkach docelowych, przyczyniając się do patologicznych procesów angiogegenezy i krzepnięcia. Natomiast Prof. Wei Guo z Uniwersytetu Pensylwanii przedstawił swoje najnowsze badania dotyczące obecności różnych receptorów, w tym białka ICAM-1, na powierzchni pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia nowotworowego. Wykazał, że dzięki ich obecności pęcherzyki te mogą specyficznie „odnaleźć” swoje cele, takie jak aktywowane limfocyty T CD8+, i zahamować ich funkcjonowanie przez oddziaływanie egzosomalnej cząsteczki PD-L1 z receptorem PD-1 na limfocytach. Tym samym pęcherzyki skutecznie eliminują kluczowe dla odpowiedzi przeciwnowotworowej limfocyty efektorowe, mając wielki wpływ na potencjalne immunoterapie.
Prof. Tony Ng z King’s College of London przekonywał zaś, że pęcherzyki należy koniecznie uwzględnić w rozwoju różnych platform stratyfikacji pacjentów pod względem ryzyka, prognozy i terapii w ramach medycyny spersonalizowanej. Profil molekularny pęcherzyków może być według niego równie cennym nośnikiem informacji, co obrazowanie molekularne, czy analiza profilu genetycznego lub białkowego.
Dr Małgorzata Czystowska-Kuźmicz: Prof. Bernd Giebel, przewodniczący Niemieckiego Towarzystwa Mikropęcherzyków, ekspert w wykorzystaniu terapeutycznym mikropęcherzyków pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych, przedstawił swoje najnowsze badania nad standaryzacją produkcji mikropęcherzyków do celów terapeutycznych i ich translacją w kierunku zastosowań w klinice, podkreślając istotne problemy, które wymagają rozwiązania, zanim wprowadzi się pęcherzyki do kliniki. Prof. Ewa Zuba-Surma, polska ekspert zastosowań pęcherzyków w medycynie regeneracyjnej, wyjaśniła zalety stosowania pęcherzyków w celach terapeutycznych, w porównaniu z zastosowaniem samych komórek macierzystych. A prof. Joanna Rossowska przedstawiła swoje niezwykle pomysłowe sposoby modyfikacji pęcherzyków pochodzenia nowotworowego w celu zwiększenia ich zdolności immunogennych i jednoczesnego zmniejszenia ich potencjału supresyjnego. Po takiej modyfikacji pęcherzyki te mogą posłużyć jako swoiste szczepionki przeciwnowotworowe dla komórek dendrytycznych.
Prof. Piotr Widłak zwrócił uwagę na swoje odkrycie, niezwykle ważne dla radioterapii. Chodzi o to, że pęcherzyki pośredniczą w indukowaniu przez promieniowanie jonizujące tzw. efektu sąsiedztwa (ang. bystander efekt) w okolicznych i odległych tkankach. Robią to przez indukcję w komórkach docelowych białek związanych ze stresem replikacyjnym. 

W drugim dniu konferencji odbywały się warsztaty dotyczące nowoczesnych metod izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych oraz ich charakterystyki. Na czym polega problem z izolacją EVs, a na czym - nowatorstwo zaprezentowanych metod?

Dr Małgorzata Czystowska-Kuźmicz: Problem z izolacją oraz analizą pęcherzyków z płynów biologicznych, czyli tego rodzaju pęcherzyków najbardziej użytecznych pod względem klinicznym, jest taki, że stare „klasyczne” metody nie zapewniają wystarczającego oddzielenia izolowanych pęcherzyków od towarzyszących im zanieczyszczeń białkowych (np. albuminy, lipoproteiny z osocza), co utrudnia i zniekształca późniejszą analizę, szczególnie proteomikę. Ponadto klasyczne metody izolacji, takie jak np. ultrawirowanie, prowadzą często do uszkodzenia struktury pęcherzyków i zmniejszenia ich funkcjonalności.  
Dr Beata Pyrzyńska: Prezentowane na warsztatach nowe metody izolacji i analizy próbują rozwiązać ten problem. Metoda izolacji za pomocą tzw. chromatografii wykluczenia (ang. size-exclusion chromatography), pozwala na pozbycie się większości zanieczyszczających lipoprotein przy izolacji pęcherzyków z osocza, przy jednoczesnym zachowaniu ich morfologii i funkcjonalności. Uczestnicy zapoznali się najpierw z teoretyczną podstawą metody, a następnie mieli możliwość przeprowadzenia praktycznej izolacji pęcherzyków z użyciem tej metody z autentycznej próbki osocza od pacjenta. Pod względem analizy, dotychczasowe klasyczne metody pozwalały tylko na analizę zbiorczą składu molekularnego pęcherzyków. Obecnie pod wpływem badań wskazujących na niezwykłe zróżnicowanie mikropęcherzyków w próbach biologicznych, naukowcy wskazują na konieczność analizy pojedynczych mikropęcherzyków, tzw. „single-vesicle analysis”. Na warsztatach prezentowano dwie najnowsze metody takich analiz: cytometrię przepływową w skali nano (nano flow cytometry) z użyciem cytometru Aurora firmy Cytek oraz analizę śledzenia cząstek (nanoparticle tracking analysis, NTA) z fluorescencją z użyciem aparatu Zetaview Quatt firmy Particle Metrix. Uczestnicy analizowali wyizolowane przez siebie wcześniej mikropęcherzyki na aparacie ZetaView.

Agenda konferencji

Sesja 1: Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w immuno-onkologii i badaniach nad rakiem

Prof. Theresa L. Whiteside, Uniwersytet w Pittsburgu, USA: „Potencjalna rola egzosomów z osocza chorych na raka jako biomarkerów rozwoju nowotworów”

Prof. Monika Pietrowska, Narodowy Instytut Onkologii im. Marii Skłodowskiej-Curie - Państwowy Instytut Badawczy, Oddział w Gliwicach: „Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek czerniaka – ich rola w rozwoju nowotworu”

Prof. Janusz Rak, Uniwersytet McGill, Montreal, Kanada: „Wpływ onkogenów na regulacyjne szlaki sygnałowe związane z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi”

Prof. Wei Guo, Uniwersytet Pensylwanii, USA: „Znaczenie egzosomów w immunosupresji i rozwoju nowotworu”

Prof. Joanna Rossowska, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda Polskiej Akademii Nauk, Wrocław: „Rola modyfikowanych egzosomów pochodzenia nowotworowego w modulacji mikrośrodowiska nowotworowego”

Prof. Tony Ng, King’s College London, Wielka Brytania: „Wykorzystanie egzosomów jako element kompleksowej, wielopoziomowej strategii stratyfikacji ryzyka pacjentów nowotworowych pod kątem progresji choroby w odpowiedzi na leczenie”

Sesja 2: Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w klinice: zastosowanie terapeutyczne, wpływ na leczenie nowotworów

Prof. Ewa Zuba-Surma, Uniwersytet Jagielloński, Kraków: „Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek macierzystych jako regulatory pro-regeneracyjne w odnowie tkanek”

Prof. Bernd Giebel, Uniwersytet Duisburg-Essen, Niemcy: „Potencjał kliniczny pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych i wyzwania związane z ich translacyjnym zastosowaniem”

Prof. Piotr Widłak, Gdański Uniwersytet Medyczny, Gdańsk: „Zjawisko sąsiedztwa („bystander effect”) indukowane przez promieniowanie jonizujące za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych związane jest ze stresem replikacyjnym w komórkach docelowych”

Sesja 3
Badania związane z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi w ramach projektu EVIONA na WUM

Beata Pyrzyńska, Warszawski Uniwersytet Medyczny: „Negatywny wpływ pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na skuteczność przeciwciał terapeutycznych”

Karolina Soroczyńska Warszawski Uniwersytet Medyczny: „Detekcja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających arginazę w płynach biologicznych pacjentek z endometriozą jako potencjalnych czynników immunosupresyjnych”

Magdalena Długołęcka Warszawski Uniwersytet Medyczny: „Charakteryzacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego oraz z osocza pacjentów ze zmianami w płucach metodą śledzenia nanocząstek (Nanoparticle Tracking Analysis)”