Czas ma znaczenie: niekodujące RNA w wykrywaniu rozwijającego się zawału
Celem projektu „Non coding RNAs to diagnose developing myocardial infarction – a prospective study using next generation sequencing” autorstwa lek. Eweliny Błażejowskiej jest znalezienie cząsteczek, które mogą „zdradzić”, że zakrzep w tętnicy wieńcowej dopiero się rozwija, zanim dojdzie do nieodwracalnego uszkodzenia mięśnia sercowego.
Projekt otrzymał dofinansowanie w konkursie PRELUDIUM 24 Narodowego Centrum Nauki.
Troponina: złoty standard z luką na starcie
Zawał mięśnia sercowego należy do najcięższych postaci chorób układu krążenia i pozostaje jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie. Szybkie rozpoznanie i leczenie robi różnicę: im wcześniej udrożnimy naczynie, tym mniejsza część serca ulega uszkodzeniu i tym większa szansa na powrót do sprawności.
Dziś biochemiczną podstawą rozpoznania zawału serca jest oznaczenie troponin. Troponina to białko uwalniane do krwi, gdy komórki mięśnia sercowego ulegają uszkodzeniu. Troponina jest świetnym markerem martwicy, ale jeśli pytamy o naprawdę wczesne wykrycie zawału serca, pojawiają się kluczowe ograniczenia. W zawale troponina rośnie dopiero wtedy, gdy martwica już się rozpoczęła - czyli pokazuje skutek, a nie sam początek procesu zakrzepowego. Co więcej, w podejrzeniu zawału troponinę trzeba oznaczać dwukrotnie. To wydłuża diagnostykę - pacjent musi czekać na kolejne pobranie krwi i wynik, a decyzja o leczeniu lub bezpiecznym wypisie zapada później. Ponieważ troponina utrzymuje się w krwiobiegu długo, potrafi też utrudniać ocenę, czy doszło do kolejnego incydentu. Dodatkowo troponina może być podwyższona również w innych stanach niezwiązanych bezpośrednio z zawałem, np. w zatorowości płucnej, sepsie czy niewydolności nerek, co czasem utrudnia interpretację wyniku.
W praktyce oznacza to wielogodzinną obserwację i powtarzanie badań u części pacjentów. Tymczasem u wielu chorych zakrzep w tętnicy wieńcowej tworzy się już ponad dobę przed wystąpieniem bólu w klatce piersiowej, a „starszy” zakrzep wiąże się z gorszym rokowaniem. To właśnie ten etap – krytyczny, bo potencjalnie jeszcze odwracalny – chcemy uchwycić.
Niekodujące RNA: małe cząsteczki, wielka informacja
Kiedyś mówiono o nich „genetyczne śmieci”. Dziś wiemy, że niekodujące RNA (ncRNA) to jedni z najważniejszych regulatorów pracy komórek. Nie służą do produkcji białek, ale potrafią działać jak mikroprzełączniki - włączając lub wyciszając całe zestawy genów. W krwiobiegu krążą różne klasy ncRNA: mikroRNA (miRNA), PIWI interacting RNA (piRNA), małe jąderkowe RNA (snoRNA) oraz fragmenty pochodzące z tRNA (tRF).
Z punktu widzenia diagnostyki najciekawsze jest to, że ncRNA mogą pojawiać się we krwi szybko w odpowiedzi na stres komórkowy i procesy toczące się w naczyniach. Są też wyjątkowo stabilne, w dużej mierze dlatego, że często „podróżują” w ochronnych nośnikach, które zabezpieczają je przed rozpadem. Dzięki temu można je mierzyć metodami laboratoryjnymi w sposób powtarzalny, a w przyszłości potencjalnie także szybko. Co ważne, dotychczasowe badania pokazały, że część miRNA potrafi rosnąć we krwi wcześniej niż troponina, ale wyniki nie zawsze są spójne między badaniami i populacjami. Dlatego potrzebne jest podejście szerokie i „bez uprzedzeń”, a nie ograniczone do kilku wytypowanych cząsteczek.
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe: kurierzy z wnętrza naczyń
Jednym z takich nośników niekodującego RNA są pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) – mikroskopijne „paczki” otoczone błoną, aktywnie uwalniane przez komórki. EV przenoszą także inne różne cząsteczki, w tym RNA, i biorą udział w komunikacji między komórkami. Dla nas to szczególnie ciekawe, bo EV mogą selektywnie „pakować” RNA uwalniane przez komórki w stresie, a więc potencjalnie niosą bardziej swoistą informację o procesie zakrzepowym niż RNA krążące swobodnie w osoczu.
To podejście wynika z naszych wcześniejszych doświadczeń z projektu LEMONADE, gdzie badaliśmy pęcherzyki u pacjentów zgłaszających się do szpitala z bólem w klatce piersiowej. Widzieliśmy, że wybrane pęcherzyki pochodzenia płytkowego mogą mieć wartość diagnostyczną nawet wtedy, gdy wyjściowa troponina jest jeszcze ujemna. Te wyniki były obiecujące, ale same pomiary liczby pęcherzyków i markerów na ich powierzchni nie dawały jeszcze wystarczającej dokładności, aby myśleć o prostym teście do rutynowego użycia. Stąd pomysł, aby pójść dalej - w stronę analizy ich „ładunku”, czyli ncRNA.
Jak będziemy szukać nowych biomarkerów?
Pracujemy na próbkach osocza od 98 pacjentów z badania LEMONADE: 34 osoby ostatecznie rozpoznane jako zawał mięśnia sercowego oraz 64 osoby, u których ból w klatce piersiowej miał inną przyczynę (kardiologiczną lub pozasercową). Materiał jest już zebrany i przechowywany w warunkach biobankowania. W takich projektach diabeł tkwi w szczegółach, dlatego próbki przygotowano według ujednoliconego protokołu – tak, aby różnice w wynikach wynikały z biologii choroby, a nie z technicznych niuansów pobrania czy przygotowania krwi.
W pierwszym etapie wyizolujemy małe ncRNA zarówno z osocza, jak i z frakcji wzbogaconej w EV. Pęcherzyki będziemy izolować metodą, która działa jak bardzo precyzyjne sito (tzw. chromatografia wykluczania wielkości), dzięki czemu otrzymujemy frakcję bogatą w EV, a uboższą w „przypadkowe” białka. Następnie, w wybranej grupie 20 próbek, wykonamy sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). To metoda „odkrywcza”: zamiast szukać jednego z góry wytypowanego markera, możemy zobaczyć szeroki profil ncRNA i wyłonić cząsteczki, które najlepiej odróżniają pacjentów z OZW (ostre zespoły wieńcowe) od pozostałych – już w momencie przyjęcia do szpitala.
W drugim etapie wybierzemy do dziesięciu najbardziej obiecujących kandydatów i zweryfikujemy je u wszystkich 98 pacjentów metodą qRT PCR. To technika szybka, czuła i możliwa do standaryzacji w laboratoriach diagnostycznych – a więc taka, która ma realną szansę przełożenia na przyszły test. Sprawdzimy też, jak poziomy wybranych ncRNA wiążą się z cechami klinicznymi pacjentów (np. charakterystyką bólu), z troponiną w chwili przyjęcia oraz ze wskaźnikami stanu zapalnego.
Trzeci etap dotyczy rokowania. Zbadamy, czy profil ncRNA z ostrej fazy wiąże się z ryzykiem nawrotu zdarzeń niedokrwiennych w ciągu 3 lat obserwacji (np. ponownego zawału, rehospitalizacji czy zgonu sercowego). Dane molekularne połączymy z informacjami klinicznymi i laboratoryjnymi, aby stworzyć model ryzyka użyteczny dla lekarza i pacjenta, a także lepiej zrozumieć, jakie procesy biologiczne stoją za obserwowanymi zmianami RNA.
Nowość: dwa „źródła” informacji i szersze spojrzenie na RNA
Wiele dotychczasowych badań skupiało się głównie na mikroRNA. My chcemy spojrzeć szerzej - uwzględniając także piRNA i snoRNA, czyli cząsteczki rzadziej analizowane w kontekście OZW. Równolegle porównamy dwa „nośniki” informacji: ncRNA krążące swobodnie w osoczu oraz ncRNA zamknięte w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych. To może odpowiedzieć na pytanie, gdzie sygnał jest bardziej swoisty dla rozwijającego się zakrzepu i czy w pęcherzykach kryje się „czystsza” informacja o mechanizmie choroby.
Co może zyskać pacjent?
Jeśli uda się zidentyfikować panel ncRNA, który wzrasta wcześniej niż troponina, korzyści mogą być bardzo praktyczne. U pacjentów z wysokim ryzykiem zawału serca diagnoza mogłaby paść szybciej, co skraca drogę do leczenia i ewentualnej pilnej interwencji. Z drugiej strony, u części chorych z bólem o innej przyczynie możliwe byłoby szybsze i bezpieczniejsze wykluczenie zawału serca - bez niepotrzebnie długiej obserwacji i części inwazyjnych badań. Dla systemu ochrony zdrowia oznacza to lepsze wykorzystanie zasobów: mniej korków diagnostycznych w SOR i bardziej celowane kierowanie pacjentów na właściwą ścieżkę.
Projekt realizujemy na Warszawskim Uniwersytecie Medycznym we współpracy z ośrodkami mającymi doświadczenie w analizie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Być może to właśnie „mikroskopijne wiadomości” zapisane w RNA pozwolą w przyszłości powiedzieć pacjentowi: zawał dopiero się rozwija – i wciąż mamy czas, by mu zapobiec. Wierzymy, że to krok w stronę szybszej, bardziej spersonalizowanej diagnostyki i lepszego rokowania.