Biomateriały naturalnego pochodzenia na pomoc w gojeniu się ran

Projekt pod kierunkiem lek. Mateusza Rybki pt. “Wpływ opatrunku keratynowego wzbogaconego M-CSF na gojenie się rany w modelu cukrzycy typu 2 u szczura - badanie pilotażowe” otrzymał dofinansowanie Narodowego Centrum Nauki w konkursie PRELUDIUM 23 [nr grantu UMO-2024/53/N/NZ4/03697].    

Dlaczego rany w cukrzycy goją się trudniej? 

Prawidłowy proces gojenia się ran składa się z czterech faz: hemostazy (zahamowania krwawienia), zapalenia (oczyszczenia, usunięcia martwych tkanek), proliferacji (odbudowy uszkodzonej tkanki) oraz remodelingu (przebudowy tkanki i zamieniania się w bliznę). Jeśli którakolwiek z nich zostanie zaburzona, rana przestanie się goić prawidłowo. Powstające w ten sposób rany przewlekłe znacząco obniżają jakość życia, a niekiedy i jego długość. W skali kraju pacjenci z ranami przewlekłymi stanowią poważne wyzwanie dla systemu opieki zdrowotnej. 

Jedną z chorób, w których proces gojenia się ran przebiega w sposób nieprawidłowy, jest cukrzyca typu II. Najbardziej zaburzona jest w niej faza zapalna, jednak warto zaznaczyć, że nieprawidłowości dotyczą wszystkich etapów procesu gojenia. Występujące w cukrzycy typu II uszkodzenia: naczyń krwionośnych (angiopatia), nerwów obwodowych (neuropatia) oraz przewlekła hiperglikemia (stan podwyższonego stężenia glukozy w surowicy krwi) wpływają negatywnie na funkcjonowanie komórek zaangażowanych w regenerację organizmu, co często prowadzi do powstania charakterystycznych ran przewlekłych - zespołu stopy cukrzycowej. Zespół stopy cukrzycowej to jedno z groźniejszych powikłań cukrzycy. Nierzadko prowadzi do amputacji kończyny, znacznie pogarszając komfort życia chorych. Dodatkowo zwiększa ryzyko poważnych infekcji, które mogą zagrażać zdrowiu, a nawet życiu.

Niestety, zapadalność na cukrzycę wciąż rośnie, a dostępne metody leczenia ran u chorych często okazują się niewystarczające. Dlatego tak ważne jest poszukiwanie nowych, bioaktywnych opatrunków, które mogłyby znaleźć zastosowanie w terapii ran przewlekłych w tym schorzeniu.    

Keratyny – białka o wielu obliczach    

Opatrunki keratynowe zyskują coraz większe zainteresowanie naukowców zajmujących się gojeniem ran. Choć biomateriały keratynowe są wykorzystywane już od wielu dekad, dopiero niedawno zaczęto wzbogacać je dodatkowymi substancjami, które mogą wspierać procesy regeneracyjne. 

Keratyny tworzą dużą rodzinę białek – jest ich ponad 40 różnych typów. Naturalnie występują w strukturach takich jak włosy, paznokcie, a u zwierząt także w sierści czy futrze.

Różne keratyny pełnią odmienne funkcje w procesie gojenia ran, a ich występowanie zależne jest zarówno od ich lokalizacji w skórze, jak i od fazy gojenia. Niektóre keratyny wspierają wzrost i proliferację (namnażanie się) komórek, podczas gdy inne uczestniczą w ich migracji i prawidłowej adhezji (łączeniu się) komórek. Dobra współpraca między tymi białkami jest kluczowa dla regeneracji tkanki. W ranach przewlekłych często obserwuje się niedobory konkretnych keratyn, zwłaszcza tych odpowiadających za pobudzanie proliferacji komórek poprzez regulację aktywności białek zwanych cyklinami. 

Rola komórek układu odpornościowego w gojeniu się ran

Obok keratynocytów – komórek naskórka oraz fibroblastów – komórek tkanki łącznej, które odpowiadają za złączenie brzegów rany, kluczową rolę w gojeniu ran pełnią także komórki układu odpornościowego: neutrofile, limfocyty oraz – kluczowe w moim projekcie - makrofagi.

Na wczesnym etapie fazy zapalnej do rany napływają neutrofile, które inicjują stan zapalny i usuwają martwe komórki z loży rany. Z czasem neutrofile ustępują miejsca limfocytom i makrofagom, które modulują intensywność reakcji zapalnej w zależności od potrzeb organizmu, umożliwiając przejście procesu gojenia w fazę proliferacji. 

W trudno gojących się ranach cukrzycowych obserwuje się przedłużone utrzymywanie się zwiększonej liczby neutrofilów oraz innych komórek ostrego stanu zapalnego. Przełamanie tego zjawiska jest kluczowe dla skutecznej terapii ran przewlekłych.

Makrofagi stanowią jedne z najważniejszych komórek, koordynując przebieg kolejnych etapów naprawy tkanek. Dzielimy je na dwie główne polaryzacje: M1 oraz M2. Podział ten jest uproszczeniem rzeczywistości, jednak z perspektywy terapii ran przewlekłych wystarcza do zrozumienia roli makrofagów w procesie gojenia. 

Makrofagi M1 wspierają neutrofile w indukcji krótkotrwałego, kontrolowanego stanu zapalnego. Prowadzą do fagocytozy martwych komórek i przygotowują tkankę do dalszych etapów gojenia. Z kolei makrofagi M2 produkują cytokiny przeciwzapalne, takie jak TGF-β i IL-10, wspomagają angiogenezę oraz proces formowania się blizny. To właśnie prawidłowa aktywność makrofagów M2 często decyduje o tym, czy rana zostanie skutecznie wygojona, czy przekształci się w przewlekłą, trudno gojącą się zmianę.

Nowoczesne biomateriały i ich unikalne właściwości    

Znając rolę komórek układu odpornościowego w gojeniu, warto przyjrzeć się również właściwościom samego opatrunku, który ma im stworzyć optymalne warunki do działania. W 1989 roku Terence D. Turner zaproponował zestaw cech, które powinien spełniać idealny opatrunek - wyznacznik, do którego do dziś dążą twórcy nowoczesnych materiałów medycznych.

Turner podkreślał, że opatrunek powinien tworzyć w ranie wilgotne środowisko sprzyjające regeneracji, jednocześnie pochłaniając nadmiar wysięku, by nie dopuścić do uszkodzenia skóry. Biomateriał musi być dobrze tolerowany przez organizm, nie może wywoływać żadnych reakcji zapalnych. Ponadto opatrunek powinien pozwalać na swobodny przepływ powietrza i pary wodnej, co wspiera odpowiednią wymianę gazową, a także utrzymuje stabilną temperaturę w miejscu rany. Oczywiście opatrunek musi być tak wytworzony, aby jego wymiana była możliwa bez bólu i ryzyka uszkodzenia delikatnej, nowo powstałej tkanki. Biomateriał wytworzony zgodnie z tymi zasadami sprawia, że cały proces gojenia przebiega sprawniej i skuteczniej.

Keratyny okazały się wyjątkowo obiecującym materiałem do produkcji nowoczesnych opatrunków. Naukowcy na całym świecie opracowali różne hydrożelowe i hydrokoloidowe formy opatrunków bazujących na rozpuszczalnych frakcjach keratyn. Jednak znacznie mniej uwagi poświęcono nierozpuszczalnym frakcjom keratyny, które mogą posłużyć do tworzenia bioaktywnych opatrunków o unikalnej strukturze. Takie opatrunki, często w formie zasypek (en. scaffolds), tworzą w loży rany swoiste rusztowanie, które sprzyja migracji komórek wzdłuż włókien keratynowych i przyspieszają proces gojenia. Co ważne, do pozyskania nierozpuszczalnej frakcji keratyny nie trzeba stosować toksycznych i szkodliwych dla środowiska rozpuszczalników, które zwykle wykorzystywane są przy produkcji opatrunków z frakcji rozpuszczalnej.

Badania na modelach zwierzęcych potwierdziły skuteczność opatrunków bazujących na nierozpuszczalnej frakcji keratyny w leczeniu ran chirurgicznych zarówno u zwierząt zdrowych, jak i tych z cukrzycą typu I. Potencjał tych biomateriałów jest jednak znacznie szerszy. Dzięki unikalnej architekturze opatrunku możliwe jest jego wzbogacanie dodatkowymi substancjami, które pozwalają modyfikować jego właściwości w zależności od potrzeb pacjenta. Z powodzeniem stworzono keratynowe zasypki zawierające nanocząsteczki srebra, o działaniu antybakteryjnym, maślan sodu o właściwościach przeciwzapalnych, a nawet opioidowe środki przeciwbólowe. Wszystkie te substancje uwalniane były z opatrunku przez kilka dni w sposób przewidywalny i powtarzalny.

W trudno gojących się ranach zastosowanie biomateriałów keratynowych reguluje lokalną odpowiedź układu odpornościowego. Opatrzone nimi rany zawierają większą ilość limfocytów i makrofagów - komórek kluczowych w ograniczaniu przewlekłego stanu zapalnego. Szczególnie istotne było szybkie pojawienie się makrofagów M2, które już po kilku dniach były obecne w ranie opatrzonej. W ranie nieopatrzonej ten sam proces trwał nawet dwa tygodnie. Wykazano, że przyspieszenie tego zjawiska ma fundamentalne znaczenie dla skutecznej terapii ran cukrzycowych.

Kiedy opatrunek staje się terapią celowaną – keratyna i M-CSF

W skórze zmiana polaryzacji makrofagów w kierunku fenotypu M2 odbywa się głównie pod wpływem cytokin takich jak IL-4 i IL-13. Ponadto istotną rolę w tym procesie odgrywa czynnik stymulujący kolonie makrofagów (M-CSF, CSF-1). Główna funkcja M-CSF w organizmie to regulacja proliferacji, różnicowania oraz aktywacji monocytów czyli komórek, z których powstaną nasze makrofagi. W kontekście gojenia ran, ma to szczególne znaczenie, gdyż prowadzi to do szybszej odnowy komórek oraz modulacji odpowiedzi immunologicznej. 

W swoim projekcie planuję stworzyć innowacyjny opatrunek oparty na nierozpuszczalnej frakcji keratyny, wzbogacony o czynnik stymulujący kolonie makrofagów (M-CSF), a następnie sprawdzić jego skuteczność w leczeniu ran u szczurów z jatrogennie indukowaną cukrzycą typu II. Wykorzystanie tego rodzaju opatrunków wciąż stanowi niewielki fragment wszystkich badań nad biomateriałami keratynowymi. Większość dotychczasowych prac skupiała się na prostszych modelach, takich jak rany u zdrowych gryzoni czy zwierząt z cukrzycą typu I. Choć rany przewlekłe mogą występować u pacjentów zarówno z cukrzycą typu I, jak i typu II, to właśnie ta druga forma choroby pojawia się częściej i znacznie obniża jakość życia chorych.

W ranach powstałych u osób z cukrzycą typu II dochodzi do zaburzeń w wielu kluczowych szlakach sygnałowych odpowiedzialnych za prawidłowe gojenie, takich jak PI3K/AKT czy JAK/STAT. Ich aktywność można zwiększyć między innymi dzięki takim cytokinom, jak M-CSF. Mimo wszystko, mechanizmy działania M-CSF w procesach regeneracyjnych skóry pozostają słabo poznane i wymagają dalszych badań, zwłaszcza w tak złożonych modelach jak zwierzęta z cukrzycą typu II.

Głównym celem działań w ramach projektu jest opracowanie nowej klasy opatrunków, które będą w stanie modulować zaburzone procesy immunologiczne obserwowane w ranach przewlekłych. Poza samą oceną skuteczności opatrunku w stymulowaniu gojenia, przeprowadzimy także badania histologiczne, immunohistochemiczne oraz molekularne. Potwierdzenie efektywności opatrunku pozwoli zgłębić mechanizmy, dzięki którym keratyna i M-CSF wpływają na odpowiedź immunologiczną w miejscu rany.

Wykazanie skuteczności tak skonstruowanego opatrunku będzie ważnym krokiem naprzód w rozwoju biomateriałów, których mechanizm działania jest ukierunkowany na precyzyjną regulację konkretnych procesów i szlaków sygnałowych. Mamy nadzieję, że wyniki naszych badań przyspieszą prace nad wytworzeniem nowej klasy opatrunków, które w przyszłości z powodzeniem znajdą zastosowanie w praktyce klinicznej.